La clé du séquençage d’Edman est le réactif phénylisothiocyanate (PITC), appelé réactif d’Edman. Lorsque l'extrémité N-terminale d'une protéine n'est pas bloquée, le PITC interagit facilement avec le résidu N-terminal d'un peptide à un pH alcalin, produisant ainsi un dérivé d'acide aminé phénylthiocarbamoyl. Sans détruire les liaisons peptidiques des autres résidus dans le peptide séquencé, la séquence N-terminale peut être déterminée avec précision en retirant et en identifiant l'acide aminé N-terminal marqué. Lorsque l'extrémité N-terminale d'une protéine est cyclisée et bloquée, le groupe -amino à l'extrémité N-terminale est modifié (-amino acétylation, méthylation, pyroglutamate, etc.), entraînant un manque de groupes -amino libres à l'extrémité N-. terminus, ce qui entraîne l'incapacité du PITC à se lier réellement à la protéine et rend finalement impossible le déroulement direct de la réaction de dégradation d'Edman. Par conséquent, le séquençage d’Edman présente certaines limites.
Si l'extrémité N-terminale a été modifiée chimiquement ou si des acides aminés non - - sont rencontrés, le séquençage de dégradation d'Edman ne peut pas être utilisé. Pour le blocage N-terminal, les échantillons qui répondent aux exigences peuvent être sélectionnés en fonction de la situation spécifique (50 % des protéines naturelles N-terminales ont été modifiées dans la nature, et les modifications courantes incluent l'acétylation, la méthylation, le pyroglutamate, etc.) ; si l'extrémité N-terminale est bloquée en raison de la réaction de détergents ou de produits chimiques dans la solution avec les groupes fonctionnels de l'extrémité N-terminale de l'échantillon de protéine, ou si la valeur du pH du solvant utilisé pour la séparation et la purification est trop élevée, sélectionnez l'option l'enzyme correspondante pour éliminer la modification de l'extrémité N-terminale de la protéine, ou utiliser la spectrométrie de masse pour identifier la modification de l'extrémité N-terminale ; si la modification qui provoque le blocage N de la protéine est connue, la protéase correspondante peut être utilisée pour supprimer la modification de l'extrémité N-terminale, puis la réaction de dégradation d'Edman peut être utilisée pour le séquençage.
La technologie actuelle de séquençage d'Edman ne peut mesurer que la séquence de résidus d'acides aminés 30-60 de l'extrémité N-terminale de la protéine, ce qui limite l'analyse et la détermination de la séquence protéique complète. Bien entendu, le séquençage d’Edman peut également être utilisé pour analyser la séquence protéique complète en prétraitant l’échantillon protéique. Tout d’abord, la protéine est coupée en plusieurs peptides courts à l’aide d’une protéase, puis les séquences peptidiques courtes sont mesurées séquentiellement à l’aide de la méthode de séquençage d’Edman. Enfin, la séquence protéique complète peut être mesurée par épissage de séquence.
Le séquençage Edman n’est généralement pas utilisé pour déterminer l’emplacement des liaisons disulfure et le débit est faible, il est donc impossible d’analyser plusieurs protéines simultanément. Les avantages de l’identification par spectrométrie de masse et du séquençage Edman peuvent être combinés pour obtenir une identification des protéines à haut débit et une détermination précise des séquences.